為了研究腸道微生物群在Pax5+/-小鼠PB-ALL發(fā)育中的作用，我們建立了一個(gè)由24只對照仔鼠野生型(WT)和24只Pax5+/-雌性小鼠組成的小鼠隊(duì)列。每籠飼養(yǎng)6只小鼠，分別飼養(yǎng)在混合基因型籠子(每個(gè)基因型3只，籠子1-4)或相同基因型籠子(同一基因型6只小鼠，籠子5-8)中(圖1A)。

為了分析腸道菌群，我們收集了移植到CF后1個(gè)月和10個(gè)月的所有小鼠的糞便顆粒。提取了DNA后，并對16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增測序。對16S rRNA測序數(shù)據(jù)的分析不僅顯示了小鼠的聚集性(藍(lán)色的CF與紅色的SPF)，而且CF的微生物組成隨著時(shí)間的推移發(fā)生了巨大的變化，但SPF沒有變化(圖1B)。在兩種基因型(圖1C和D)的β多樣性結(jié)果中，根據(jù)動(dòng)物設(shè)施的類型，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的、統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(p=<0.005，PERMANOVA)。在接下來的9個(gè)月里，CF和SPF之間的差異變得更加顯著(圖1E和F)。在轉(zhuǎn)移到CF時(shí)，小鼠出生6周(從斷奶到成年)，小鼠腸道微生物群應(yīng)該是完全發(fā)育的，但仍然容易受到環(huán)境誘因引起的組成變化的影響。

圖1-1

我們通過獨(dú)立地將機(jī)器學(xué)習(xí)方法應(yīng)用于3983個(gè)ASV，進(jìn)一步將基因型分離ASV的集合細(xì)化到只有40個(gè)。ASV根據(jù)特征重要性進(jìn)行排序，由“隨機(jī)森林”算法確定，41個(gè)ASV用50%的樣本進(jìn)行訓(xùn)練，并在剩余50%的樣本上進(jìn)行測試。這40個(gè)ASV足以準(zhǔn)確(96.8%)預(yù)測小鼠基因型(圖1G)。事實(shí)上，這種機(jī)器學(xué)習(xí)工具能夠預(yù)測小鼠的基因型，這證實(shí)了Pax5雜合性形成了特定的腸道微生物群落。值得注意的是，16S rRNA全長測序使我們僅使用5212個(gè)全長ASV中的4個(gè)，就進(jìn)一步提高了Pax5+/-和WT動(dòng)物之間的基因型預(yù)測的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確率達(dá)到100%(圖1H)。WT和Pax5+/-小鼠微生物群的主要區(qū)別在于Pax5+/-小鼠缺乏完整的共生菌。具體地說，在WT小鼠中可以檢測到的Rikenellaceae、S24-7和Oscillospira屬的成員在CF的Pax5+/-小鼠的微生物群落中缺失(圖1I)。在SPF中，在Pax5+/-小鼠的微生物群落中沒有檢測到Rikenellaceae和Oscillospira屬的成員(圖1J)。

圖1-2

Sca1-ETV6-RUNX1小鼠在SPF組10個(gè)月時(shí)和CF組3~4個(gè)月時(shí)進(jìn)行微生物群分析。將這些數(shù)據(jù)與我們之前的分析相結(jié)合，證實(shí)了環(huán)境(設(shè)備)和基因型是形成腸道微生物群的關(guān)鍵因素(圖2A，B)。SourceTracker2分析表明，Pax5+/-微生物來源在Sca1-ETV6-RUNX1微生物群的組成中也很突出(圖2C)，PERMANOVA分析結(jié)果證實(shí)，所分析的基因型形成的微生物群有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(圖2D)。使用10個(gè)最重要的ASV(有1000棵樹的隨機(jī)森林)，可以通過機(jī)器學(xué)習(xí)準(zhǔn)確地預(yù)測易感基因型(圖2E)。這些分析證實(shí)，在遺傳上易患PB-ALL的基因型都有不同的微生物群，獨(dú)立于外圍的B細(xì)胞有缺陷。

?圖2

我們設(shè)立了第二個(gè)小鼠隊(duì)列，命名為“ABX”，并用抗生素治療這些小鼠以清除細(xì)菌。這個(gè)隊(duì)列由27只Pax5+/-和18只WT小鼠組成，我們在轉(zhuǎn)移時(shí)(在服用抗生素之前)、抗生素治療后4周和8周收集糞便顆粒，然后每兩周收集一次，直到一只小鼠出現(xiàn)明顯的PB-ALL癥狀或達(dá)到其自然壽命的終點(diǎn)。通過微生物分析、糞便DNA濃度分析和16S rRNA擴(kuò)增序列測定(圖S7)，證實(shí)了抗生素雞尾酒的殺菌效果。在抗生素治療期間從小鼠身上收集的糞便樣本主要包含來自它們植物性飲食的Read(平均82%的Read可以歸類為葉綠體或線粒體來源)。當(dāng)我們分析抗生素治療對不同器官造血室的影響時(shí)，我們觀察到抗生素治療并不改變WT或Pax5+/-小鼠的B細(xì)胞發(fā)育。然而，在抗生素治療后，我們觀察到Pax5+/-小鼠外周血中成熟B細(xì)胞的減少，但未觀察到WT小鼠中成熟B細(xì)胞的減少。

圖S7

我們觀察到，在抗生素治療后通過細(xì)菌耗盡來改變微生物群并沒有改變Peyer氏斑中B細(xì)胞的數(shù)量，但與未治療的Pax5+/-小鼠相比，接受抗生素治療的Pax5+/-小鼠的CD3+-T細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖S25)。CD3+-T細(xì)胞的減少與抗癌免疫力的降低有關(guān)。因此，我們想知道T細(xì)胞數(shù)量的減少是否與接受抗生素治療的Pax5+/-小鼠的PB-ALL發(fā)展有關(guān)。我們將Pax5+/-小鼠與缺乏nu/nu小鼠的胸腺缺陷T細(xì)胞雜交。33只Pax5+/-；nu/nu小鼠中有5只(15%)觀察到PB-ALL發(fā)育，而WT；nu/nu對照組小鼠(n=31)均未觀察到PB-ALL發(fā)育。

圖S25

我們考慮了在SPF條件下腸道生理性微生物群的作用，以及在沒有自然感染誘因的情況下，通過細(xì)菌枯竭來改變它是否會(huì)導(dǎo)致白血病的發(fā)生。為了測試這一點(diǎn)，另外一組出生在SPF的23只Pax5+/-小鼠沒有被轉(zhuǎn)移到CF，而是在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一直保持在SPF中。這些小鼠接受抗生素治療。

在23只小鼠中，11只(47.82%)在11.4到20.7月齡之間出現(xiàn)了PB-ALL，而SPF中未經(jīng)治療的Pax5+/-小鼠(n=12)沒有發(fā)生白血病(圖4A-D)。這些白血病在表型、組織學(xué)、克隆性和遺傳學(xué)特征上與暴露于自然感染的Pax5+/-小鼠中出現(xiàn)的白血病相似。這表明，完整的微生物群可以保護(hù)遺傳易感的小鼠免受白血病的侵襲，即使在沒有感染環(huán)境的情況下，通過抗生素治療后的細(xì)菌枯竭來改變微生物群也可能引發(fā)白血病。

?圖4

我們首先證實(shí)，抗生素治療后的微生物群落以一種依賴于基因型的方式再生，并且能夠隨著時(shí)間的推移而重建(圖5A)。接下來，我們將Pax5+/-發(fā)展為PB-ALL的小鼠的腸道微生物群與在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持健康的小鼠的腸道微生物群進(jìn)行了比較。通過對所有時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用離散FDR，我們確定了3983個(gè)已鑒定的V4-ASV中的42個(gè)在白血病前期Pax5+/-小鼠(n=144，糞便樣本)和健康Pax5+/-小鼠(n=164，糞便樣本)之間差異豐富(圖5B，C)。這些發(fā)現(xiàn)將遺傳易感性和耗盡的微生物群與那些將患上感染驅(qū)動(dòng)的PB-ALL的Pax5+/-小鼠聯(lián)系在一起。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明腸道微生物群有可能被用作早期生物標(biāo)記物來識(shí)別易患白血病的遺傳易感小鼠。

圖5

接下來，我們調(diào)查了小鼠血清中的代謝體成分是否能幫助我們識(shí)別遺傳性PB-ALL的易感性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們用GC-MS分析了SPF飼養(yǎng)的WT(n=10)和Pax5+/-(n=10白血病前期，n=10白血病)小鼠的代謝組(圖6A)。PCoA表示按基因型和健康狀況進(jìn)行聚類(圖6B)。我們發(fā)現(xiàn)52種化合物中有6種在WT和白血病前期Pax5+/-小鼠之間差異顯著(圖6C)。與白血病Pax5+/-小鼠血清樣本相比，健康的白血病前期Pax5+/-小鼠血清樣本中有16種化合物含量顯著不同(圖6D顯示了前6種化合物)。

圖6

總而言之，健康、白血病前期或白血病代謝組是不同的，并由幾個(gè)因素定義(圖7)，而不是單一的特定代謝物或細(xì)菌種類。

圖7