一代測(cè)序菌種鑒定服務(wù)簡(jiǎn)介

一代測(cè)序技術(shù)誕生于 1977 年，其核心方法是弗雷德里克?桑格發(fā)明的雙脫氧鏈終止法，又稱桑格法測(cè)序，是一種基于DNA復(fù)制原理的高精度測(cè)序技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)研究。由于其通量低，一次測(cè)序只能處理有限數(shù)量的片段，實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜、成本較高，應(yīng)用場(chǎng)景有限，因此更適合于小片段少量樣品。基于此，百邁客結(jié)合一代測(cè)序的特點(diǎn)，更傾向于該技術(shù)應(yīng)用到功能基因（含核糖體）或pCR產(chǎn)物的小規(guī)模測(cè)序。

一代測(cè)序的特點(diǎn)

1.高準(zhǔn)確性：一代測(cè)序的準(zhǔn)確性可達(dá)99.999%，適合用于驗(yàn)證基因組組裝的完整性；

2.長(zhǎng)讀長(zhǎng)：測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，適合于較長(zhǎng)的DNA片段測(cè)序；

3.低通量：與二代測(cè)序相比，一代測(cè)序的通量較低，成本較高，限制了其在大規(guī)模基因組測(cè)序的應(yīng)用。

一代測(cè)序原理

一代測(cè)序技術(shù)主要采用雙脫氧鏈終止法（Sanger法），其核心在于使用雙脫氧核苷酸（ddNTP）來(lái)中止DNA鏈的延伸。具體步驟如下：

1、反應(yīng)體系

測(cè)序反應(yīng)中包含目標(biāo)DNA片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測(cè)序引物及DNA聚合酶等。

2、鏈終止

在DNA合成過(guò)程中，ddNTP由于缺少3′-OH基團(tuán)，無(wú)法與下一個(gè)dNTP連接，從而導(dǎo)致DNA鏈的延伸中斷。

3、檢測(cè)

通過(guò)電泳分離不同長(zhǎng)度的DNA片段，并利用熒光標(biāo)記或放射性同位素進(jìn)行檢測(cè)，從而確定DNA序列。

1、DNA 提取

細(xì)菌：細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒

真菌：真菌基因組 DNA 提取試劑盒

2、PCR 擴(kuò)增

用菌種鑒定通用或定制化引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物條帶是否與目的大小相符，是否單一，有無(wú)拖帶。

3、PCR 產(chǎn)物測(cè)序

PCR 產(chǎn)物檢測(cè)合格后，切割目的條帶進(jìn)行純化回收，用回收后的產(chǎn)物在 ABI 公司的 3730XL 測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行 Sanger 測(cè)序。

4、測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析

• Sanger 測(cè)序結(jié)果用軟件 CAP3 進(jìn)行質(zhì)控拼接，得到每個(gè)樣本的 contig 序列；
• 使用 BLAST 將 contig 序列比對(duì)到 NT 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得物種信息；每個(gè) contig 序列選取 E value最小的前 10 個(gè)比對(duì)物種，結(jié)果在 03.blast 文件夾中的 all_contigs.nt_blast.xls 文件；選取 Evalue 最小的物種作為本次菌種鑒定的結(jié)果物種（如果 E value 相同，進(jìn)一步按照 score 值進(jìn)行排序，選擇 score 值最大的物種）。

菌種鑒定

功能基因測(cè)序

PCR產(chǎn)物測(cè)序