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 分類: 醫(yī)學(xué)研究

研究標(biāo)題Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease

發(fā)表雜志:CELL(IF:38.634),?2020.8.20

簡述:本文結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組(ST)和原位測序(ISS)研究人鼠大腦,揭示了兩種由淀粉樣蛋白斑沉積誘導(dǎo)的的阿爾茲海默癥(AD)多細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)—-斑塊誘導(dǎo)基因(PIG)網(wǎng)絡(luò)和少突膠質(zhì)細(xì)胞基因(OLIG)響應(yīng)。

?在AD的過往研究中,大家發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊周圍存在復(fù)雜的炎性樣改變,但我們對這種反應(yīng)的分子變化和細(xì)胞間的相互作用知之甚少。本文利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究一個AD小鼠模型,可以分辨淀粉樣斑塊周圍直徑為100μm的組織結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了一個早期髓鞘和OLIGs富集的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)變化,以及一個涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體、炎癥的PIGs多基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。作者進(jìn)一步通過人鼠大腦切片的原位測序在細(xì)胞水平證實(shí)了觀察到的大部分改變??梢哉f全基因組空間轉(zhuǎn)錄組分析為AD和其他腦部疾病提供了一種方法來解密致病特征附近的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)異常。

研究背景

NGS技術(shù)飛速發(fā)展,在生理和病理方面定義細(xì)胞狀態(tài)得到巨大進(jìn)步。例如,在AD領(lǐng)域,我們現(xiàn)在知道小膠質(zhì)細(xì)胞對β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊表現(xiàn)出典型的活化反應(yīng)。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞比小膠質(zhì)細(xì)胞更難分離,但單細(xì)胞核是一個合適的選擇。這些細(xì)胞的胞質(zhì)mRNA不能很好的展示,而且解離手段誘導(dǎo)了人為的表達(dá)改變?;镜膯栴}還是,丟失了大部分的空間信息,包括細(xì)胞和淀粉樣蛋白斑的關(guān)系。而空間轉(zhuǎn)錄組可以解決這一問題,它的空間標(biāo)簽陣列可以記錄測序分子的空間位置,無偏地分析組織上的轉(zhuǎn)錄本信息。

目前AD研究的一個中心問題是淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)退行性進(jìn)程的關(guān)系。這個斑塊可能是AD的觸發(fā)器或者驅(qū)動器。遺傳分析表明,散發(fā)性AD的風(fēng)險與小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的對淀粉樣蛋白沉積有響應(yīng)的基因有關(guān),但是星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞也對蛋白斑有分子響應(yīng)?!癆D的細(xì)胞相變”研究致力于綜合地了解這些細(xì)胞間漸變的復(fù)雜相互作用,這也確定了Aβ沉積引發(fā)的致病結(jié)果。然而,我們對淀粉樣斑塊附近細(xì)胞中發(fā)生的分子變化依然知之甚少。

 

研究方法

一、?實(shí)驗(yàn)材料

人組織:AD晚期和正常對照大腦,女性(75歲左右)
鼠:?AppNL-G-F?KI、C57BL/6J,雄性
二、?實(shí)驗(yàn)技術(shù)

空間轉(zhuǎn)錄組測序、原位測序

三、?實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

作者使用3、6、12、18月齡的AppNL-G-F和C57BL/6小鼠大腦進(jìn)行冷凍切片,每只切三片,外側(cè)做免疫組化,中間做ST(圖1A)。每個冠狀切面包含500多個TDs的轉(zhuǎn)錄譜,20個切片合計10327個轉(zhuǎn)錄譜。并對每個TD進(jìn)行了空間、病理和細(xì)胞信息的注釋。實(shí)驗(yàn)中每個TD檢測到31283± 7,441個唯一分子標(biāo)簽和6,578 ± 987唯一基因。作者將每個冠狀切片與艾倫小鼠大腦圖譜鑒定的14個解剖大腦區(qū)域進(jìn)行匹配(圖1B),并且每一個TD都被分配其中。TDs的數(shù)量介于112(內(nèi)嗅皮層ENTI)和2114(丘腦TH)之間(圖1B)。最后將三張切片整合,用Aβ負(fù)荷(6E10染色)、反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、神經(jīng)元(NeuN)以及細(xì)胞核(DAPI)對其進(jìn)行注釋。

 

圖1 | 成年小鼠大腦的空間轉(zhuǎn)錄圖譜

 

一、?成年小鼠大腦的空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

作者對10327個轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行t-SNE分析聚類(圖1C),并且對年齡和基因型也進(jìn)行了很好的區(qū)分(圖1D)。分區(qū)結(jié)果表明了ST技術(shù)可以清晰地分辨出大腦解剖區(qū)域。野生型(WT)的斑點(diǎn)在12月齡和18月齡有所重疊(圖1D紫色和紅色),而AppNL-G-F的轉(zhuǎn)錄譜在這兩個時間點(diǎn)一直改變(黃色和綠色),這也與這段時期的病理進(jìn)展一致。

二、?將基因表達(dá)變化與Aβ沉積進(jìn)行關(guān)聯(lián)

AppNL-G-F小鼠的淀粉樣沉積從3月齡左右開始(圖2A)。在18月齡的切面上,78.5–4,950 μm2區(qū)域內(nèi)有1,565 ± 167個斑塊。單個TD的直徑是100 μm,切片厚度也是100 μm。因此,有理由認(rèn)為中間切片的細(xì)胞接觸到了鄰近切片檢測到的淀粉樣斑塊。作者使用一個TD上的Aβ像素?zé)晒鈴?qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為Aβ指標(biāo)。這種方式可以區(qū)分輕微的和強(qiáng)烈的Aβ堆積(圖2B)。作者平均了每個腦區(qū)TD的Aβ指標(biāo)(圖2C),這與Aβ免疫染色一致,說明Aβ從背部往腹部皮層、丘腦、海馬區(qū)進(jìn)展。
為了解基因表達(dá)的變化,作者進(jìn)行了兩個差異表達(dá)分析。首先比較AppNL-G-F?和 C57BL/6(基因模型),其次是Aβ沉積對基因表達(dá)的影響(Aβ模型)。作者使用6個轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行經(jīng)典的RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Aβ模型(圖2D&E),根據(jù)模型,18月齡的AppNL-G-F,Cst7,Cd68,C1qa,Slc1a3,Clu和Mbp表達(dá)異常。在圖2D中可以看到,ST的數(shù)據(jù)和RNA原位雜交數(shù)據(jù)高度相關(guān),這也證實(shí)了本方法的有效性。
具有相似表達(dá)模式的基因很可能擁有相似的功能,因此可以通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)進(jìn)行模塊聚類。作者研究了10327個轉(zhuǎn)錄譜中變化程度*大的50%的基因,識別出12個模塊,并使用GOrilla提取了可能的生物學(xué)功能、Aβ暴露的表達(dá)變化、3月齡和18月齡的基因型、細(xì)胞特征、受影響的腦區(qū)。
三、?PIG模塊的鑒定

WGCNA分析中紫色的模塊被稱為PIGs,在18個月齡時,它在Aβ和基因型軸上*活躍(圖S3B)。這個模塊包含57個基因,開始時微微上調(diào)(圖3A),6-12月時在整個大腦中急劇增加至一種穩(wěn)定的狀態(tài)(圖3B)。18月齡AppNL-G-F小鼠的所有TDs在Aβ沉積和PIG中間存在一個中等但顯著的相關(guān)性(圖3C),說明PIG表達(dá)隨著整個大腦中Aβ的沉積逐漸增加。
根據(jù)GO分析,作者得出該模塊參與了經(jīng)典補(bǔ)體級聯(lián),以及補(bǔ)體級聯(lián)觸發(fā)的效應(yīng)機(jī)制,如內(nèi)吞作用,溶酶體降解、抗原處理和遞呈、免疫應(yīng)答和氧化還原過程。
作者進(jìn)一步研究了PIG模塊的細(xì)胞學(xué)特征,鑒定出其與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(疾病相關(guān)DAM或者激活響應(yīng)的ARM)和炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞(A1)有關(guān)聯(lián)(圖S3D)。重點(diǎn)突出了5個與A1標(biāo)記重疊的PIGs和15個DAM/ARM 基因(圖3D)。另外36個PIGs以前并沒有被定義為疾病相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)基因。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了前十的聯(lián)系*緊密的樞紐基因(圖3D,紅色)。作者評估這些PIGs是否可以在人數(shù)據(jù)庫中被鑒定出來。在41個細(xì)胞亞群中,與PIGs*相關(guān)的是AD相關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Mic1,圖S3E)。作者通過參與Aβ暴露和基因型的人Mic1??Marker基因的同源序列來放大基因表達(dá)變化(圖3E&F,橙&綠)。對小鼠的分析表明,人腦中的Mic1反應(yīng)是對淀粉樣蛋白斑塊的大量的多細(xì)胞協(xié)調(diào)反應(yīng)的一部分,而且這種反應(yīng)會隨著時間的推移而演變。
圖S3 | GO分析和WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

圖3?| Aβ斑塊誘導(dǎo)基因(PIGs)的鑒定

 

四、?使用原位測序在細(xì)胞分辨率下研究PIG模塊
ST展示了淀粉樣蛋白斑周圍的多細(xì)胞反應(yīng),作者尋求一種正交獨(dú)立方法從單細(xì)胞分辨率下進(jìn)行驗(yàn)證。原位測序(ISS)可以在一個反應(yīng)中使用許多靶向特異的原位標(biāo)簽。作者使用了特制的探針來繪制PIGs表達(dá)以及細(xì)胞類型標(biāo)簽(Itgam、 Cx3cr1、Csf1r對應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞;Slc1a3、Gfap 、Clu對應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞; Syp對應(yīng)神經(jīng)元; Plp1對應(yīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞;圖4A-C)。ISS實(shí)驗(yàn)中,對AppNL-G-F和兩只18月齡WT小鼠各構(gòu)建兩個文庫。用每個基因的熒光點(diǎn)數(shù)目來量化基因表達(dá),并將熒光點(diǎn)聚類到淀粉樣蛋白斑周位的5個同心圓上(圖4D)。51/54個PIGs在圈1上明顯富集,而C1qb在圈1上明顯減少(圖4E)。ISS的結(jié)果與ST的結(jié)果線相關(guān)性非常好(圖4E)。

作者開發(fā)了一種算法來檢測PIG網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞特征,通過計算5μm半徑內(nèi)的細(xì)胞類型Marker斑點(diǎn)的富集來匹配每個斑點(diǎn)到細(xì)胞型。通過預(yù)測每個Marker基因的細(xì)胞類型來驗(yàn)證這個算法(圖4G)。很明顯,PIG響應(yīng)Aβ,這主要是因?yàn)樾∧z質(zhì)細(xì)胞,小部分由于星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖4H)。而一些PIGs在多種細(xì)胞類型中明顯富集。例如,Cyba在小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。

最后,作者使用RNA原位雜交,驗(yàn)證18月齡AppNL-G-F的補(bǔ)體部分(C1qa、C4、 Clu)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了C1qaItgam陽性細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)中表達(dá),Clu?Slc1a3陽性細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá),C4Mbp陽性細(xì)胞(少突膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá),這些細(xì)胞緊挨淀粉樣蛋白斑。這三個補(bǔ)體部分的細(xì)胞特征經(jīng)過RNA原位雜交檢測,與ISS分析結(jié)果一致。

 

圖4 | ISS鑒定的PIGs細(xì)胞標(biāo)簽

 

五、?PIG模塊中小膠質(zhì)細(xì)胞基因和星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的共表達(dá)

為了探究PIGs在不同細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性在多大程度上是由累積的Aβ病理驅(qū)動的,作者僅在PIGs上使用WGCNA分析,根據(jù)Aβ標(biāo)簽分離所有ST的TDs為WT和四個AD分位數(shù)(圖5)。WGCNA生成了一個連接矩陣,表明每個基因的改變是如何與其他所有基因的關(guān)聯(lián)的。圖5展示了隨著Aβ暴露,共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)逐漸形成。

在WT中,所有PIGs的關(guān)聯(lián)相對較低,PIG被分為三個簇(圖5,綠、藍(lán)、橙)。ISS實(shí)驗(yàn)(圖4H)證明了在綠色簇中,星形膠質(zhì)細(xì)胞基因(7/12)富集,而藍(lán)色(14/23)和橙色(14/28)簇聚集了小膠質(zhì)基因中表達(dá)的PIGs。在WT中,橙色的PIGs幾乎不關(guān)聯(lián),而AppNL-G-F小鼠中,在接觸增長的Aβ后,這些PIGs的基因被招募。隨著Aβ指標(biāo)增長,PIGs內(nèi)部和相互之間的關(guān)聯(lián)增強(qiáng)。在Q4-Q1中,隨蛋白斑積累程度增加,互作關(guān)系明顯增加。

 

圖5 | 隨Aβ沉積,PIGs逐漸共表達(dá)

 

六、?少突膠質(zhì)細(xì)胞模塊的不同區(qū)域反應(yīng)
第二個變化比較大的模塊(紅色),在WGCNA(圖S3B),由165個基因構(gòu)成,他們主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),因此命名為“OLIG模塊”。這個模塊最富集的功能種類是GO:0007272包膜神經(jīng)元、GO:0043209髓鞘、GO:0008366軸突包膜以及GO:0042552髓鞘形成。模塊最富集的10個基因是髓鞘相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本:Plp1、Mbp、Mobp、Cldn11、Mal、Apod、Cnp、Trf、Fth1、Plekhb1。比較OLIG與過往發(fā)表的小鼠單細(xì)胞數(shù)據(jù),少突膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)聯(lián)很強(qiáng)(圖S3C),活化小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM/ARM)輕度關(guān)聯(lián)(圖S3E)。OLIG與人AD相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞Oli0關(guān)聯(lián)密切(圖S3E)。作者突出標(biāo)記了20個人類Oli0 markers同源序列(圖6A&B,橙色、綠色)。幾個Oli0同源序列與OLIG模塊同步上調(diào)和下調(diào)。
類似于髓鞘類(圖S3A),與3月齡和18月齡的WT小鼠相比,AppNL-G-F小鼠在OLIG模塊的基因型軸線全腦范圍上全部上調(diào)(圖6A&6B)。這種基因型效應(yīng)可能反映了小鼠大腦對人源和突變的App基因的整體反應(yīng)。但是,從基因型中把Aβ暴露(Aβ軸)分理出后,作者發(fā)現(xiàn)了一個OLIG模塊的有趣變化:在3個月時,全部呈正相關(guān),在18個月時為負(fù)相關(guān)(圖6A&6B)。在不同的大腦區(qū)域,這種反應(yīng)也有明顯的差異(圖6C)。比較圖2C中淀粉樣蛋白斑和OLIG表達(dá),可以明顯發(fā)現(xiàn)OLIG表達(dá)的主要驅(qū)動因素不是Aβ指標(biāo)而是大腦區(qū)域本身(圖6C)。在3月齡時,作者發(fā)現(xiàn)在纖維束(FB)、丘腦(TH)和下丘腦(HY)中顯著的OLIG-Aβ正相關(guān),而在內(nèi)嗅皮層(ENTI)和幾個海馬體皮層中存在顯著負(fù)相關(guān)。在18月齡時,作者在聽覺區(qū)域(AUDS)發(fā)現(xiàn)了OLIG-Aβ存在明顯負(fù)相關(guān),而在ENTI和海馬體中存在顯著正相關(guān)。
作者進(jìn)而更詳細(xì)地從Aβ指標(biāo)和OLIG表達(dá)的關(guān)系方面分析這些區(qū)域的不同。在圖2中,Aβ沉積隨疾病的進(jìn)展而不同。甚至在3個月時,有些TDs暴露于Aβ(圖5,Q1中179個TDs)。隨著Q4-Q2中TDs的Aβ緩慢增長,OLIG表達(dá)增加(圖6D)。但是,三月齡有著*高Aβ暴露(Q1,比Q4中Aβ高21倍)的TDs中OLIG的表達(dá)存在一種降低的趨勢。另外,低Aβ暴露的TDs中OLIG模塊的基因?qū)Φ倪B接強(qiáng)度之和*強(qiáng)。為了進(jìn)一步證明發(fā)現(xiàn),作者對三月齡AppNL-G-F小鼠的整個冠狀切片,設(shè)計四個OLIGs(Plp1、Mbp、Olig2Cnp)探針做RNA原位雜交(圖6E&F)。結(jié)果顯示,在三月齡小鼠稠密的淀粉樣蛋白斑周圍,這4個OLIGs明顯減少。可以推測,在輕度Aβ暴露下,OLIG模塊高表達(dá)和相互連接,但在高密度Aβ積累的微環(huán)境中表達(dá)減少。因此,部分OLIG模塊的區(qū)域差異與不同的Aβ暴露有關(guān)。
圖6 | 隨Aβ積累,OLIG模塊的時空響應(yīng)

 

七、?人腦中PIG和OLIG模塊的可視化
作者使用3名AD患者和3名正常對照組死后的人腦樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AD大腦處于淀粉蛋白斑C階段和神經(jīng)元糾纏V-VI階段的疾病進(jìn)展期。研究描繪了與AD相關(guān)的額上回組織譜,總共報告了222個基因表達(dá)譜,包括45個人PIGs同源序列,OLIG模塊中42個斑塊反應(yīng)基因的同源序列,以及一系列細(xì)胞類型Marker。這些細(xì)胞Marker很好地在細(xì)胞分辨率下描繪了大腦區(qū)域(圖7A)。PIG模塊(圖7B,紫色)和OLIG模塊(圖7C,紅色)基因如預(yù)期的在大腦灰質(zhì)和白質(zhì)中富集。
作者使用分析小鼠ISS數(shù)據(jù)的方法來研究對照組中人PIGs和AD大腦同源序列的分布。大部分PIGs在AD和對照組中相同的細(xì)胞類型中表達(dá)。在對照組中,PIG模塊中3個子模通過星形膠質(zhì)細(xì)胞(綠色簇)和小膠質(zhì)細(xì)胞(藍(lán)色和橙色簇)表達(dá)(圖7D)。然而,作者依然在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了9個富集的PIGs(LGMN、HEXB、HEXA、CTSB、CTSA、GNS、GPX4、CTSDITM2B),兩個在少突膠質(zhì)細(xì)胞中富集(LGALS3BPCD9)。PLEK、CYBALAPTM5在小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞中顯著富集,而在人類的小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著富集。作者最終確定18/45的個PIGs在淀粉斑細(xì)胞位上明顯富集,包括9個小膠質(zhì)細(xì)胞PIGs,5個星形膠質(zhì)細(xì)胞PIGs以及5個多細(xì)胞類型表達(dá)的PIGs。有趣的是,作者發(fā)現(xiàn)APOEARPC1B在小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著表達(dá),NPC2、 S100A6、ITGB5、PRDX6VSIR在AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著表達(dá),而在對照組中沒有,提示在AD患者中疾病相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞激活。
作者使用類似的方法,從OLIG模塊中差異表達(dá)*高的基因選出42個人類同源序列的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞特征分析(圖7E)。淀粉樣斑塊細(xì)胞生態(tài)位中有22個基因顯著缺失,5個基因在淀粉樣斑塊細(xì)胞生態(tài)位中顯著增高表達(dá)。有趣的是,通常由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的APOD在大腦中表達(dá),并在AD中上調(diào),在AD患者的小膠質(zhì)細(xì)胞中也顯著富集,但在對照組中沒有。
對比人和小鼠的數(shù)據(jù),需要顧及物種差異,在鼠中,只有淀粉樣斑塊誘導(dǎo)的病理進(jìn)行了研究,然而,AD的后期階段,Tau蛋白、壞死性凋亡等等對病理的額外貢獻(xiàn)導(dǎo)致病理情況變得復(fù)雜,并沒有出現(xiàn)在小鼠模型中。小鼠模型反映了疾病的早期階段,而人從淀粉斑出現(xiàn)到最終發(fā)展為癡呆需要長達(dá)20年的時間。人類疾病發(fā)生的過程會更加復(fù)雜,不過小鼠中鑒定出的PIG和OLIG模塊會在AD晚期有重要作用。
圖7 | 通過ISS使人腦中PIG和OLIG模塊可視化

 

文章總結(jié)

本文使用空間轉(zhuǎn)錄組在數(shù)百個微小組織區(qū)域(TDs)進(jìn)行原位測序,發(fā)現(xiàn)了淀粉樣蛋白斑誘導(dǎo)的全基因組轉(zhuǎn)錄組改變。同時使用正交的原位測序方法在單細(xì)胞水平分析了數(shù)百個重要基因。進(jìn)而繪制了響應(yīng)Aβ沉積的兩個基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)—-PIGs和OLIG。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白斑并不是簡單的“發(fā)病結(jié)果”,還會誘導(dǎo)一系列的基因變化 ,影響疾病進(jìn)展。

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