一、百邁客Hi-C取樣要求

1、基本要求

1.1安全

1)人身安全：現(xiàn)有實驗條件下（采取一定防護(hù)后），樣品對實驗人員本身無傷害

2)環(huán)境安全：樣品對室內(nèi)、室外環(huán)境無影響（以免因為不小心導(dǎo)致一些活體樣本進(jìn)入外界 環(huán)境造成不良影響）

1.2無污染

1)植物樣本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有蟲害（尤其是一些肉眼不容易發(fā) 現(xiàn)的蟲卵等）

2)全血樣品不得引入取血物種本身攜帶的病菌、病毒等潛在污染

1.3依據(jù)“理論”&“實踐”

1)“理論”：基于各種實驗原理的理論依據(jù)

2)“實踐”：基于 BMK 本身積累的多物種、多樣品的項目經(jīng)驗

1.4送樣說明

1)客戶或銷售人員應(yīng)將樣本的信息詳細(xì)說明，所有樣品必須標(biāo)注好關(guān)鍵樣品信息：如物種名 稱、樣品名稱、到樣日期、是否需要返樣等

2)樣品信息單必須早于或與樣品同時到達(dá)公司，一則方便樣品中心錄樣，二則方便項目盡快 啟動

3)因為樣品首次取樣不足、質(zhì)量不好或信息單未及時到位造成項目進(jìn)度延后時需要由客戶或 銷售部承擔(dān)相關(guān)責(zé)任（特殊項目除外）

4)因公司內(nèi)部培養(yǎng)條件不能同時滿足各種物種的生長需求，因此，送達(dá)活體樣品應(yīng)該盡量是 送到即可進(jìn)行實驗的樣品（量足，質(zhì)好），不建議在公司保存過長時間，防止培養(yǎng)樣本死亡

5)所有需要特殊關(guān)注的樣品，在華開任務(wù)單中需要備注相關(guān)信息，并提前郵件通知 Hi-C 相關(guān) 注意事項；特殊物種需要書面告知材料培養(yǎng)條件（光、溫度、水、肥 or 有機(jī)營養(yǎng)物等等）

6)生長狀態(tài)趨于不好的樣品，或一些離體枝條需要提前與實驗溝通，保證到樣后可及時處理 樣品

1.5法定節(jié)假日期間和周末送樣要求

1)節(jié)假日當(dāng)天及假日前后各一周不建議再到樣， 如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實驗平臺溝通送樣需求

2)周末休息日2 天不建議到樣，如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實驗平臺溝通送樣需求

2、動物樣本-全血

2.1新鮮血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后立即送樣，并盡量確 保 24h 內(nèi)運至實驗室

2.2凍存血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后直接液氮速凍，干冰 運輸

2.3血液需求量

每一個樣品，建議送樣 1~2 mL

2.4全血取樣注意事項（防止污染、溶血）

1)取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液 樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染

2)準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）

3)依據(jù)抗凝管的實際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL 規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL

4) 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

5)天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運輸時使用冰袋低溫運輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運輸時無需加冰袋 運輸

3、動物樣本-組織標(biāo)本

3.1凍存樣品取樣要求

1)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

2)應(yīng)將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈

3)直接液氮速凍干冰運輸

3.2凍存組織樣品理論用量

組織量 2 g 為佳，最少 1 g；1 g 可滿足 3 個文庫構(gòu)建，最低要求至少 0.2 g

4、動物樣本-細(xì)胞

4.1取樣要求

需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)固定后送樣

4.2細(xì)胞樣品量要求

一般來講 2*10^6個細(xì)胞滿足一個 Hi-C 文庫，建議培養(yǎng)到 107 個細(xì)胞用于固定，以保證 試驗的可重復(fù)性， 由于細(xì)胞的數(shù)量可能會影響 Hi-C 試驗的質(zhì)量，因此需要細(xì)胞數(shù)目盡量精確

4.3交聯(lián)細(xì)胞

1) 取 10^7 個新鮮活細(xì)胞置于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 的 cold 1×PBS 搖勻，1000 g， 4℃離心 2 min

2)吸棄上清，每管再次加入 10 mL 的 cold 1×PBS 輕混勻，1000g ，4℃離心 2 min

3)吸棄上清，用 10 mL cold 1 × PBS 重懸沉淀，加入適量（570 μL）37%甲醛（終濃度 2%）混勻，室溫放置 10 min(1-2 min 混勻一次)；（注意甲醛需要使用 sigma 等進(jìn)口品 牌，以免影響固定效果，也可以由當(dāng)?shù)劁N售申請實驗室寄送固定試劑）

4)加適量（710 μL）2 M 的甘氨酸（常溫保存）終止反應(yīng)（終濃度 0.125 M），室溫混勻5min，冰上放置15min

5)固定好的細(xì)胞 600 g 4℃ 離心 8 min ，棄上清

6)1 mL cold PBS 重懸沉淀，600g 4℃ 離心 8 min ，去上清

7)液氮速凍干冰運輸或-80℃保存

注：做到此步直接液氮速凍，干冰運輸，信息單中備注：“細(xì)胞交聯(lián)完成”

5、真菌樣本

5.1凍存樣品—“慢凍快融”或“直接速凍 ”

1) 應(yīng)保證菌體為對數(shù)生長期，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

2)直接液氮速凍干冰運輸

5.2組織樣品理論用量

組織量 1 g 為佳，最少 0.2 g

6、植物樣本

6.1活體植株

1)幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗、組培苗——全部葉片、部分幼嫩莖

2)成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片

3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1g

4)其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件，以保證樣品的正常生長

6.2離體枝條

1)枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉（到樣后會選擇葉片進(jìn)行實驗）；枝條中下端保留部分成熟葉片

2)枝條預(yù)處理：剪斷枝條， 自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋， 袋中 噴水，填充部分空氣，密封袋口

3)枝條運輸： 自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運輸），冰袋與自封袋 間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷

4)運輸時間：保證 24h內(nèi)到樣，最多不得超過 3天

5)取樣量：保證每一個庫的理論用量1g

6)其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過大等導(dǎo)致的取樣或運輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實驗；離體枝條如果保存、運輸不善會存在部分潛在風(fēng)險：即得到的實驗效果可能會比活體植株檢測結(jié)果 稍差（理論上的潛在風(fēng)險）

6.3凍存植物組織

6.3.1凍存組織風(fēng)險

1)植物組織液氮速凍后容易造成破碎，導(dǎo)致后續(xù)固定等操作無法有效實施

2)植物組織破碎嚴(yán)重時會對核甚至染色體造成物理機(jī)械損傷

6.3.2取樣要求

1)從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于 2mL或更大體積的旋蓋凍存管中，每份植物> 1 g，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，植物> 1 g/份，以防部分樣品降解重新取材、制備或送樣

6)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）

7)運送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運輸

6.4其他植物樣本

1)非葉片（活體植株）：有常規(guī)提取經(jīng)驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

2)非葉片（離體植株）：處理與運輸與離體枝條相同，有常規(guī)提取經(jīng)驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1 g

4)非葉片樣品適用于葉片難提取的植株或老師的特殊要求，此類樣品DNA提取失敗的風(fēng)險高于葉片樣本，需要銷售與老師交代清楚

6.5植物取樣注意事項

1)建議一次送樣量在 1~4g

2)所有待取的幼嫩組織長勢必須正常（無病蟲害、無營養(yǎng)缺失）

3)對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉

4)因為通常裸子植物比被子植物更難選擇適合的解離液，裸子植物的葉子大多為針形、 線形、鱗形，葉片表面有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物多，這對提取完整的細(xì)胞核極為不利，因此，選取

萌發(fā)的新鮮幼苗作為材料會更合適

5)客戶沒有條件寄送活體植物樣本時，可以選擇自己固定，由當(dāng)?shù)劁N售像實驗室申請寄送固定試劑 ( β-巰基乙醇需要老師自己準(zhǔn)備）

7、Hi-C交聯(lián)流程

1)配制NIBuffer工作液 1 ，配制好后置于冰上放置

2)取2g新鮮幼嫩組織樣品，用冰水清洗干凈

3)用剪刀將樣品組織剪碎，放置于50mL 離心管中

4)加入上述配制好的NIBuffer 工作液1

5)加入 2 mL 36%甲醛溶液，室溫條件下，旋轉(zhuǎn)雜交爐中反應(yīng) 90 min

6)加入2.5 mL 2M甘氨酸，連續(xù)手搖 5 min終止交聯(lián)反應(yīng)

7)濾掉液體，用滅菌水清洗至無泡沫為止

8)吸干樣品表面水分，將樣品置于預(yù)冷的50ml離心管中，并將管置于液氮中

9)-80℃保存或干冰寄送

二、百邁客 ATAC-seq 取樣要求

1、生物學(xué)重復(fù)

取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。盡可能做到重復(fù)在取樣時間、部位、處理條件等方 面保持一致，不同樣本的性別、年齡盡量相同，否則可能會影響實驗結(jié)果的可重復(fù)性及可信度

每個處理至少3個生物學(xué)重復(fù)

2、樣品的保存與運輸

簡單處理并標(biāo)記后，應(yīng)立即浸入液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱，以免實驗操作前 樣品降解的可能性

3、取樣要求

3.1組織樣本

1)獲取組織樣本

A.動物：取下新鮮的組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪等雜質(zhì)部分，用預(yù)冷的 1×PBS 溶液漂洗，將組織表面的殘留血液沖洗干凈

B.植物：從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中 ，每份組 織>50mg ，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，組織>50mg/份，以防部分樣品降解重新取材、 制備或送樣

6)運送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運輸

7)注意事項

A.昆蟲類樣本建議進(jìn)行饑餓處理后送樣

B.若樣本有微生物污染（細(xì)菌、病毒等），實驗過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會有污染

3.2細(xì)胞樣本

3.2.1貼壁細(xì)胞

3.2.2懸浮細(xì)胞

1)細(xì)胞獲取

A.將貼壁細(xì)胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細(xì)胞懸液

B.確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好

2)按照 50萬個細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們再挑選 5萬個相對完整的細(xì)胞核進(jìn)行實驗）

3)小心吸去全部上清，加入 500 μL 預(yù)冷的 1×PBS 溶液洗滌，4℃ 、500G 離心 5min

4)小心吸去全部液體，加入 1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細(xì)胞沉淀混勻， 管壁標(biāo)記樣本名稱，慢速梯度降溫凍存

5)梯度降溫可參考：4 度 10min＞負(fù) 20 度 30min＞負(fù) 80 度過夜＞液氮凍存

6)將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰 進(jìn)行運輸

7)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，50萬個/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣

注：若細(xì)胞樣本有支原體污染，實驗過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會有污染

3.3全血樣本

1)新鮮血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝 素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，確保

5天內(nèi)運至實驗室

2)凍存血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，平衡

2 h 后直接液氮速凍，干冰運輸

3)注意事項

A.取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染

B.準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）

C.依據(jù)抗凝管的實際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL

D.取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

E.天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運輸時使用冰袋低溫運輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運輸時無需加冰袋運輸