研究背景

病毒感染后，CD8 +?T細(xì)胞擴(kuò)增并分化成不同類型的效應(yīng)細(xì)胞，抗原遷移至炎癥部位殺死抗原表達(dá)細(xì)胞。 清除病毒后，大多數(shù)抗原特異性CD8+T細(xì)胞會(huì)死亡，但一小部分長壽命的記憶細(xì)胞仍然存在。綜合性研究已經(jīng)確定了與該過程相關(guān)的蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。在效應(yīng)時(shí)期，細(xì)胞可表達(dá)與增殖、遷移和細(xì)胞毒性相關(guān)的基因。病毒清除后，多數(shù)基因表達(dá)恢復(fù)初始狀態(tài)，但許多關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（Tbx21,Prdm1）、遷移因子（Cd44, Cxcr3）和細(xì)胞因子受體（Il12rb, Il18ra）的水平仍處于高水平以確保可快速恢復(fù)效應(yīng)狀態(tài)。

更重要的是，小鼠和人在效應(yīng)及記憶T細(xì)胞分化中已觀察到一些相似的基因程序。這些研究集中于編碼轉(zhuǎn)錄本的水平，但目前關(guān)于非編碼轉(zhuǎn)錄本在這一過程中的表達(dá)變化鮮有報(bào)道。作者基于之前工作采用RNA-seq展開研究，以鑒定響應(yīng)病毒感染的人和小鼠CD8 +?T細(xì)胞中長非編碼RNA（lncRNA）表達(dá)的變化。通過lncRNA測序研究，鑒定出上百條未注釋的lncRNA，基于表達(dá)分析可以將lncRNA對初始、效應(yīng)和記憶CD8+T細(xì)胞亞群分類，意味著在抗原啟動(dòng)分化過程中它們可能參與決定不同分化命運(yùn)。通過小鼠與人類lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)具有保守性的lncRNA。

材料和方法

●?LCMV感染及細(xì)胞分選： LCMV病毒感染小鼠，分選不同類型的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)RNA測序。

●?LncRNA測序研究：基于RNA-seq進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)分析。5組類型細(xì)胞，包括native、終末分化效應(yīng)T細(xì)胞（short-livedterminal effector ,TE）、記憶前體T細(xì)胞（memory precursor ，MP)、中心記憶T細(xì)胞（central memory ，CM) 、效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory ，EM)，每組3個(gè)重復(fù)。

●?生信分析：轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)分析、同源性分析。

●?RACE驗(yàn)證。

研究結(jié)果

1、通過小鼠CD8+T細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，基于轉(zhuǎn)錄組組裝發(fā)現(xiàn)未注釋基因，以及T細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNA的動(dòng)態(tài)變化。

從LCMV感染小鼠中分離病毒特異性的CD8+T細(xì)胞亞群，對不同類型的細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq。包括初始T細(xì)胞、終末分化效應(yīng)T細(xì)胞（short-livedterminal effector ,TE）、記憶前體T細(xì)胞（memory precursor ，MP)、中心記憶T細(xì)胞（central memory ，CM) 、效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory ，EM)?；跀?shù)據(jù)組裝分析，共鑒定到13909個(gè)unique genes，75%是蛋白編碼基因，25%是非編碼。在非編碼基因中，三分之一在數(shù)據(jù)庫中未收錄，因?yàn)檎J(rèn)為是新基因。這些新基因比已注釋非編碼基因有較高的表達(dá)水平，但這兩類基因均比編碼基因低表達(dá)。采用CPAT進(jìn)行編碼潛能分析，大部分新轉(zhuǎn)錄本包括單個(gè)外顯子，不到25%的新轉(zhuǎn)錄本包括2個(gè)及以上外顯子。雖然不具有蛋白編碼潛能，但大部分新基因在CD8+T細(xì)胞分化過程中表現(xiàn)出特異性，包括記憶細(xì)胞中的特異性表達(dá)。

在13909基因中，與初始細(xì)胞相比，有5266個(gè)至少在一個(gè)細(xì)胞亞型中差異表達(dá)。感染過程中，884個(gè)lncRNA差異表達(dá)，其中有525個(gè)未注釋。在感染8天后的TE和MP細(xì)胞之間有181個(gè)差異非編碼基因，其中123個(gè)未注釋。48天后，378個(gè)非編碼（230新基因）與初始相比顯著差異表達(dá)，但在CM和EM細(xì)胞相比，167個(gè)差異基因表達(dá)，29個(gè)為非編碼（20個(gè)新的）。

2、lncRNA表達(dá)分析分類CD8+T細(xì)胞亞群。

由于在CD8+T細(xì)胞分化過程中表現(xiàn)出來的差異表達(dá)，進(jìn)一步通過PCA分析是否可以對不同亞群細(xì)胞分類。結(jié)果表明編碼基因、非編碼和新基因均可以分類。其中組裝得到的新基因分類結(jié)果與編碼基因分類結(jié)果一致，說明這些新基因?qū)細(xì)胞的分化及功能的重要性。為進(jìn)一步鑒定特異性lncRNA，篩選具有類似表達(dá)模式的差異基因。鑒定出14個(gè)差異表達(dá)的cluster，其中非編碼與編碼并未表現(xiàn)出cluster分離，表明二者有相似的表達(dá)過程。比如一些非編碼基因在CD8+T細(xì)胞激活后表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，在記憶期維持效應(yīng)水平，與編碼基因Cd44和Cd200類似。第8天的MP和TE細(xì)胞相比，差異lncRNA存在于一些cluster中（clusters 4, 8, and 13 ），表明lncRNA可能涉及T細(xì)胞早期分化命運(yùn)。

3、人抗原特異性CD8+T細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的表達(dá)分析。

基于之前健康志愿者的測序數(shù)據(jù)（采用YFV-17D黃熱疫苗，分選CD8+T細(xì)胞，收集初始T細(xì)胞，14天CD8+T細(xì)胞、28天CD8+T細(xì)胞、記憶細(xì)胞），進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。鑒定出已注釋的3165個(gè)非編碼轉(zhuǎn)錄本，1098個(gè)未注釋的。與小鼠數(shù)據(jù)相比，人數(shù)據(jù)中也表現(xiàn)出編碼基因表達(dá)高于非編碼基因。同樣許多鑒定的新轉(zhuǎn)錄本是單外顯子，編碼潛能低于鼠鑒定的轉(zhuǎn)錄本。與小鼠數(shù)據(jù)類似，許多新轉(zhuǎn)錄本在T細(xì)胞分化中表現(xiàn)出特異性。

基于差異分析，4099個(gè)基因至少在一個(gè)分化時(shí)期顯著變化，838個(gè)是非編碼基因。28.3%的編碼基因在感染過程中顯著變化。非編碼基因中，相比已知lncRNA，28.3%新lncRNA在感染后顯著差異表達(dá)，已知lncRNA占比16.7%。接下來同樣進(jìn)行PCA分析lncRNA在分化過程中的作用。與小鼠數(shù)據(jù)相似，基于編碼基因、非編碼基因及新基因?qū)細(xì)胞分為3類：初始、效應(yīng)及記憶細(xì)胞。非編碼基因的分類結(jié)果與編碼基因結(jié)果類似?；诰垲惙治觯?1個(gè)表達(dá)的cluster。與小鼠數(shù)據(jù)類似，編碼基因與非編碼基因并未表現(xiàn)出cluster分離。并且有一些時(shí)期特應(yīng)性的cluster，比如cluster3在激活后上調(diào)且在病毒清除后保持該水平，cluster2則恢復(fù)到初始狀態(tài)，cluster1則接近于初始水平。許多下調(diào)基因在記憶形成后恢復(fù)到初始水平（cluster11），但有些基因比初始狀態(tài)更低（cluster10）。結(jié)合小鼠測序數(shù)據(jù)，結(jié)果表明非編碼基因在多種哺乳動(dòng)物CD8+T細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。

4、CD8+T細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)的保守性。

由于lncRNA在小鼠與人數(shù)據(jù)表現(xiàn)出的生物學(xué)過程相似性，將兩者轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對。僅有一部分小鼠lncRNA包含人轉(zhuǎn)錄本同源序列，當(dāng)然也會(huì)存在比對到人編碼基因及假基因上的序列。許多同源lncRNA在對比物種上有多個(gè)同源基因座。除了序列保守，共線性（位置保守）也是考慮因素。因此接下來分析T細(xì)胞分化過程中保守性的lncRNA。通過比較二者效應(yīng)和記憶期基因的差異倍數(shù)，但在任一個(gè)階段未發(fā)現(xiàn)保守且表達(dá)顯著相關(guān)的基因。但這些保守性基因在這2個(gè)時(shí)期表現(xiàn)出中度相關(guān)(r = 0.36 and 0.46, p = 0.0007 and 0.0008, respectively)。

小結(jié)

文章基于RNA測序?qū)π∈骉細(xì)胞不同階段的基因表達(dá)進(jìn)行綜合比較，鑒定出不同階段特異表達(dá)的基因，包括已知和新的lncRNA，其可能參與作用于細(xì)胞分化過程。此外，通過與人的測序數(shù)據(jù)相比較，具有序列保守的lncRNA在二者間的表達(dá)類似，表明在CD8+T細(xì)胞分化過程中的進(jìn)化保守性。

參考文獻(xiàn)

Hudson WH, Prokhnevska N, et al.?Expression of novel long noncoding RNAs defines?virus-specific effector and memory CD8+?T cells. Nature Communications, 2019.

 

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