中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統(tǒng)的方法預測對IBD療法的反應。抗炎藥物美沙拉嗪，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結腸內發(fā)揮作用；然而，隨著時間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應或最終失去反應。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點

1、來自IBD患者的多組學研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項目炎癥性腸病多組學數(shù)據(jù)庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩?。–D）或潰瘍性結腸炎（UC）患者的糞便樣本進行多組學分析，共鑒定了1036個宏基因組（MGX）、440個元轉錄本（MTX）和508個非靶向代謝組（MBX），以及283個MBX-MGX對和213個MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內直接調節(jié)的特定糞便代謝物，結果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細菌代謝產物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調節(jié)代謝物水平方面具有最大的預測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個獨立的IBD患者隊列中鑒定并驗證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙?；?-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進行生物轉化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來確定參與5-ASA生物轉化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進行轉錄組分析，最終鑒定了兩個顯著過表達的具有推定乙酰轉移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個具有乙酰輔酶a乙酰轉移酶結構域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計算與N-乙酰5-ASA相關的每個元轉錄組基因簇的敏感性和特異性，結果發(fā)現(xiàn)了另外7個假定的乙酰轉移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關。最終得到的12個之前未被表征的候選乙酰轉移酶可分為硫解酶和?；o酶A N-?；D移酶兩組，其中?；o酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關的乙酰轉移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和酰基輔酶A N-乙酰轉移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測硫解酶和酰基輔酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的酰基輔酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙酰化5-ASA采用體外質譜分析，最終證實了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙?；钚?，結果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙酰化，這表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個預測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠將5-ASA乙?；癁镹-乙酰基5-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙酰化5-ASA，將FcTHL的乙?；磁潴w晶體結構疊加在乙酰化硫解酶晶體結構上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結構進行比對，進一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點，最終揭示了活性位點區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙酰化活性的證實

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關

基于臨床服用5-ASA的個體差異性，接下來檢查12種乙酰轉移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關。收集39名在任何時間點接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調整與疾病風險相關了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉移酶基因與類固醇起始風險增加顯著相關。4種乙酰轉移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開始使用類固醇的更高風險顯著相關。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風險和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風險的增加顯著相關；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關。隨后使用混合效應模型對參與者進行調整，發(fā)現(xiàn)存在三個或更多乙酰轉移酶基因也與類固醇使用風險增加相關，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊列中得到了驗證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風險相關

研究總結

本研究結果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個體通常進展為風險更高的免疫抑制治療，而只有在必要時 (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準醫(yī)學提供有價值的生物標志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學機制可能有助于未來研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來加強我們的發(fā)現(xiàn)，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗還是通過單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個性化微生物醫(yī)學打開了一扇概念之窗。