1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動(dòng)物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠(chǎng)家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4?粗體核酸純化

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠(chǎng)家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠(chǎng)家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1?檢測(cè)方法

• 濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：廠(chǎng)家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠(chǎng)家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠(chǎng)家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2?判定標(biāo)準(zhǔn)

• 總量≥2μg（單次建庫(kù)）
• 濃度≥50ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.0-3.0之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q在8-2.5之間
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1?建庫(kù)流程

1. 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
2. 使用BluePippin進(jìn)行片段篩選
3. 使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A
4. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列
5. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2?建庫(kù)試劑

• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix貨號(hào)?M6630L 廠(chǎng)家?NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module貨號(hào)E7546L ?廠(chǎng)家NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 ?貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠(chǎng)家Nanopore

3.3?建庫(kù)設(shè)備

• 數(shù)字 3*32PCR 儀??廠(chǎng)家?Appliedbiosystems???儀器規(guī)格?proflex3*32
• 制冷型程控五段金屬浴??廠(chǎng)家?天根生化科技（北京）有限公司??儀器規(guī)格?OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1?上機(jī)操作

• 用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
• 用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)
• 用 PromethION ?Flow ?Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開(kāi)始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2?測(cè)序試劑

• 測(cè)序芯片制備試劑盒??貨號(hào)?EXP-FLP004 ??廠(chǎng)家?Nanopore
• 測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒??貨號(hào)?EXP-AUX003 ?廠(chǎng)家?Naonopore
• 測(cè)序芯片??PromethION Flow Cell(R10.4.1)??貨號(hào)?FLO-PRO114M ??廠(chǎng)家?Nanopore

4.3?測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀??廠(chǎng)家?Nanopore???儀器規(guī)格?PromethION48

發(fā)表期刊：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)

發(fā)表時(shí)間：2020年11月

影響因子：2.302

研究背景

蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis，簡(jiǎn)稱(chēng)球囊菌）是專(zhuān)性侵染蜜蜂幼蟲(chóng)的致死性真菌病原，引發(fā)的白堊病是長(zhǎng)期危害養(yǎng)蜂生產(chǎn)的頑疾，不僅可導(dǎo)致蜜蜂幼蟲(chóng)的大量死亡，還能導(dǎo)致成年蜜蜂數(shù)量的銳減以及蜂群群勢(shì)和蜂產(chǎn)品產(chǎn)量的驟降。目前，球囊菌的基因組注釋信息尚不完善，高質(zhì)量參考轉(zhuǎn)錄組匱乏，嚴(yán)重限制了球囊菌的組學(xué)和分子生物學(xué)研究。

材料和方法

球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離、純化和保存。純化得到的純凈菌絲樣品和孢子樣品經(jīng)液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＠眉{米孔長(zhǎng)讀段測(cè)序技術(shù)對(duì)球囊菌的純化菌絲（Aam）和純化孢子（Aas）分別進(jìn)行測(cè)序，將高質(zhì)量的三代測(cè)序數(shù)據(jù)混合后用于構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，并通過(guò)比對(duì)主流數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋?zhuān)瑫r(shí)對(duì)球囊菌的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行鑒定和分析。

結(jié)果

1、納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

球囊菌菌絲和孢子的納米孔測(cè)序分別得到6321704和6259727條原始讀段，N50分別達(dá)到1094和1157bp，平均長(zhǎng)度分別為992和1047bp，長(zhǎng)的長(zhǎng)度分別為9421和13060bp（表1）。來(lái)源于A(yíng)am和Aas的原始讀段的長(zhǎng)度分布介于1-10kb以上，其中分布reads數(shù)多的長(zhǎng)度均為1kb（圖1-A、1-B）；原始讀段的Q值分布介于Q6-Q15，分布reads數(shù)多的質(zhì)量值分別為Q9和Q11（圖1-C、1-D）。

圖1球囊菌菌絲和孢子納米孔長(zhǎng)讀段測(cè)序的原始讀段長(zhǎng)度和質(zhì)量值分布Fig.1Lengthandqualitydistributionofrawreadsgeneratedfromnanoporelong-readsequencingofA.apismyceliumandspore

2、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的鑒定和分析

進(jìn)一步過(guò)濾冗余全長(zhǎng)有效讀段，分別得到9859和16795條非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，N50分別達(dá)到1482和1658bp，平均長(zhǎng)度分別達(dá)到1187和1303bp，長(zhǎng)的長(zhǎng)度分別為6472和6815bp（表2）；上述非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度介于1-7kb，其中分布在1kb的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)多。進(jìn)一步對(duì)Aam和Aas的非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Venn分析，結(jié)果顯示有6512個(gè)非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為菌絲和孢子所共有，分別有3347和10283個(gè)非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為二者特有（圖2-A）。

圖2球囊菌菌絲和孢子全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的Venn分析(A)、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)˙）Fig.2Vennanalysisoffull-lengthtranscriptsinA.apismyceliumandspore(A)、Nrdatabaseannotationoffull-lengthtranscripts(B)

3、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

在球囊菌菌絲和孢子中共鑒定出20142條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，分別有20809、11151、17723、12164、11340和9833全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本可注釋到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。注釋全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多的物種是球囊菌、Polytolypahystricis和莢膜組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatum）（圖2-B）

4、lncRNA的鑒定及分析

利用CPC、CPAT、CNCI和Pfam4種方法依次鑒定出1906、1682、750和648條lncRNA，四者的交集為648個(gè)（圖3-A）；其中基因間區(qū)lncRNA（longintergenicRNA，lincRNA）、反義鏈lncRNA（anti-senselncRNA）和正義鏈lncRNA（senselncRNA）的數(shù)量分別為480、119和49個(gè)（圖3-B）。

圖 3 球囊菌 lncRNA 的數(shù)量（A）和種類(lèi)（B） Fig. 3 Number (A) and type (B) of A. apis lncRNAs

總結(jié)

構(gòu)建和注釋了球囊菌的高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，為探究球囊菌轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性、完善參考基因組的序列和功能注釋信息以及深入開(kāi)展球囊菌可變剪接體的功能研究提供了關(guān)鍵依據(jù)。

深度挖掘數(shù)據(jù)和拓展

同期作者利用納米孔全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）和另一蜜蜂真菌病原東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosemaceranae）的現(xiàn)有參考基因組在結(jié)構(gòu)功能注釋上進(jìn)行了較好的完善，同時(shí)也對(duì)基因的可變剪接（alternativesplicing，AS）和可變多聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA）進(jìn)行解析。通過(guò)gffcompare軟件將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本與參考基因組注釋的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，對(duì)基因組注釋基因的非編碼區(qū)向上游或下游延伸，修正基因的邊界。利用MISA軟件鑒定長(zhǎng)度在500bp以上的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）位點(diǎn)信息。使用Blast工具將鑒定到的新基因和新轉(zhuǎn)錄本比對(duì)Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，從而獲得功能注釋。通過(guò)Astalavista軟件鑒定基因的AS事件類(lèi)型，統(tǒng)計(jì)分析可變剪切的結(jié)果。采用TAPISpipeline對(duì)基因的APA位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，得到APA的位點(diǎn)信息。分別利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam4種方法對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行預(yù)測(cè)，取四者的交集作為高可信度的lncRNA。研究結(jié)果較好地優(yōu)化了現(xiàn)有的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和蜜蜂球囊菌參考基因組已注釋基因的結(jié)構(gòu)和功能注釋信息，并補(bǔ)充和注釋了大量參考基因組未注釋的新基因和新轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)也為其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鑒。

研究背景

在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，RNA剪接是將遺傳變異與精神疾病聯(lián)系起來(lái)的關(guān)鍵機(jī)制。剪接圖譜在大腦中特別多樣，很難準(zhǔn)確識(shí)別和量化。短讀長(zhǎng)RNA-Seq方法不能準(zhǔn)確地重建和定量大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)異構(gòu)體，為解決這一挑戰(zhàn)，本文將long-range PCR和nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與一種新的生信分析流程結(jié)合。

CACNA1C是一種精神危險(xiǎn)基因，編碼電壓門(mén)控鈣通道CaV1.2，CACNA1C基因很大而且很復(fù)雜，至少有50個(gè)注釋外顯子和31個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本。它的大小和復(fù)雜性使得用標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)方法準(zhǔn)確鑒定和量化轉(zhuǎn)錄本變得極其困難，本文在人腦中鑒定了CACNA1C的全長(zhǎng)編碼轉(zhuǎn)錄本，識(shí)別了38個(gè)新的外顯子和241個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)異構(gòu)體多樣性的詳細(xì)了解對(duì)于將精神病學(xué)基因組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為病理生理學(xué)見(jiàn)解和新的精神藥理靶點(diǎn)至關(guān)重要。

研究方法

樣本：來(lái)自利伯腦發(fā)育研究所儲(chǔ)存庫(kù)的三名成年捐贈(zèng)者的尸檢腦組織（提取小腦、紋狀體、背外側(cè)前額葉皮質(zhì)、扣帶回、枕葉和頂葉皮質(zhì)的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）
測(cè)序方法：使用PCR擴(kuò)增CACNA1C全長(zhǎng)CDS，使用MinION進(jìn)行測(cè)序
分析流程：https：//github.com/twrze/TAQLoRe

研究結(jié)果

1、CACNA1C有很多外顯子和異構(gòu)體

由于CACNA1C的復(fù)雜性，本文使用了兩種互補(bǔ)的方法來(lái)鑒定轉(zhuǎn)錄本：外顯子水平和剪接位點(diǎn)水平的分析，分析流程見(jiàn)補(bǔ)充圖2。該方法共鑒定了251種存在于人腦中獨(dú)特的CACNA1C轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中241種是新的，包括使用新的外顯子，新的剪接位點(diǎn)和連接。

補(bǔ)充圖2

在CACNA1C基因座內(nèi)總共注釋了39個(gè)潛在的新外顯子，其中38個(gè)在至少2個(gè)人或組織中被識(shí)別，并在每個(gè)文庫(kù)中得到至少5條nanopore reads的支持（圖2A）。通過(guò)PCR和Sanger測(cè)序確認(rèn)了新的外顯子與其周?chē)淖⑨屚怙@子之間的剪接連接，從而驗(yàn)證了四個(gè)新的外顯子。這種新的外顯子的成功驗(yàn)證提供了很高的可信度，即通過(guò)納米孔測(cè)序鑒定的新的外顯子是真實(shí)的，并且被整合到CACNA1C轉(zhuǎn)錄本中。表達(dá)量最高的10條轉(zhuǎn)錄本中，有9條是新的且其中有8條被預(yù)測(cè)保持CACNA1C閱讀框架，這表明這些最豐富的新轉(zhuǎn)錄本中有一些編碼功能不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體（圖2B,C）。這些結(jié)果表明，新的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐富，數(shù)量也很多，目前的注釋缺少許多最豐富的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本。

圖2

通過(guò)設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的高置信度，在6個(gè)大腦區(qū)域確定了90個(gè)高可信的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本，包括7個(gè)先前注釋的(GENCODE V27)和83個(gè)新的(補(bǔ)充圖3)。7個(gè)新的高置信度轉(zhuǎn)錄本包含新的外顯子，而其余76個(gè)包含以前未描述的連接和連接組合。

補(bǔ)充圖3

上述外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本鑒定方法為鑒定新的外顯子和表征全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)提供了穩(wěn)健和保守的手段。使用了更為保守的依賴(lài)于連接處無(wú)錯(cuò)誤映射所支持的連接的識(shí)別，以及規(guī)范剪接位點(diǎn)的方法，確定了497個(gè)新的剪接位點(diǎn)，其中393個(gè)由至少10條reads支持，這些剪接位點(diǎn)，在篩選了至少24條reads支持的轉(zhuǎn)錄本后，鑒定了195個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中111個(gè)被預(yù)測(cè)為編碼的。

2、CACNA1C亞型在不同腦區(qū)的表達(dá)譜不同

小腦、紋狀體與皮質(zhì)等組織觀(guān)察到了CACNA1C轉(zhuǎn)錄本差異，但在不同個(gè)體之間的表達(dá)是相似的。在小腦中觀(guān)察到了明顯的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)轉(zhuǎn)換；在小腦之外，ENST00000399641是主要的轉(zhuǎn)錄本，而在小腦中，ENST00000399641和CACNA1C n2199的表達(dá)水平相似。

圖3 C

3、預(yù)測(cè)新isoforms對(duì)CaV1.2蛋白模型的影響

CACNA1C編碼CaV1.2 的主要成孔亞基。鈣孔由24個(gè)跨膜重復(fù)序列組成，由細(xì)胞內(nèi)環(huán)連接成4個(gè)結(jié)構(gòu)域(I-IV)(圖4A)。在我們鑒定的83個(gè)新的外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本中，51個(gè)可能編碼功能性的CaV1.2通道?；疑娇虮硎拘碌?、框架內(nèi)的插入和刪除的位置（值表示包含每個(gè)isoforms的reads的平均比例）。使用兩種分析方法（外顯子水平和剪切連接水平）鑒定變體的情況，外顯子水平計(jì)數(shù)用于得出豐度(紅色文本)；僅使用剪接位點(diǎn)水平方法鑒定的變體用藍(lán)色文本表示。包含三個(gè)微缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量：(I)在I-II接頭中，(Ii)在IV4-5接頭中，以及(Iii)在IV3-4接頭中先前報(bào)道的微缺失(圖4B)。

圖4

總結(jié)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為準(zhǔn)確獲得轉(zhuǎn)錄多樣性提供了可能，因?yàn)槊恳粭lread都包含一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本。這對(duì)于具有復(fù)雜模型的基因尤其重要。由于CACNA1C剪接產(chǎn)生的CaV1.2蛋白對(duì)現(xiàn)有的鈣通道阻滯劑表現(xiàn)出不同的敏感性，因此有可能選擇性地針對(duì)疾病相關(guān)的CACNA1C亞型和/或那些在大腦與外周差異表達(dá)的CACNA1C亞型，提供既更有效又更無(wú)外周副作用的新型精神藥物。綜上，這些觀(guān)察結(jié)果證明了ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)τ跍?zhǔn)確描述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和選擇性剪接的重要性。

參考文獻(xiàn)：
Clark Michael B,Wrzesinski Tomasz,Garcia Aintzane B et al. Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain.[J] .Mol. Psychiatry, 2020, 25: 37-47.

第一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用了Sanger雙脫氧鏈終止法，它的讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%，但測(cè)序前需要對(duì)特定區(qū)段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)且通量低，很難應(yīng)用于組學(xué)方面的研究。基于此特點(diǎn)，涌現(xiàn)出二代測(cè)序技術(shù)，它主要的特點(diǎn)為短讀長(zhǎng)，高通量。以Illumina?Solexa為例，它采用邊測(cè)序邊合成的方法，首先利用超聲波將DNA打斷成200-500bp小片段文庫(kù)，加接頭后DNA片段隨機(jī)附著于flowcell表面，經(jīng)過(guò)橋式PCR擴(kuò)增形成“DNA簇”，實(shí)現(xiàn)堿基信號(hào)強(qiáng)度放大，采用邊合成邊測(cè)序的方法，進(jìn)行全基因組全面，準(zhǔn)確的測(cè)序。

圖1? NovaSeq 6000

百邁客目前主要應(yīng)用2017年Illumina平臺(tái)推出的NovaSeq系列測(cè)序平臺(tái)，雖然較于以往二代平臺(tái)，它的測(cè)序質(zhì)量值、Index的測(cè)序識(shí)別、DNA文庫(kù)冗余度等指標(biāo)有了明顯提升，但無(wú)法克服短讀長(zhǎng)的reads 在基因組組裝、大片段變異檢測(cè)、轉(zhuǎn)錄組、甲基化等研究中的短板?；诖饲闆r，三代測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生。

目前，三代測(cè)序的主要代表為PicBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）這兩大測(cè)序平臺(tái)，以O(shè)NT平臺(tái)為例，它主要通過(guò)電信號(hào)識(shí)別堿基序列，單鏈DNA/RNA通過(guò)納米孔（蛋白通道），不同的堿基會(huì)形成特征性離子電流變化信號(hào)，通過(guò)對(duì)這些信號(hào)的檢測(cè)，得到堿基序列，完成測(cè)序。與二代相比，它主要的優(yōu)勢(shì)在于在測(cè)序前，不會(huì)將DNA樣品打斷成小片段，而是對(duì)我們提取DNA進(jìn)行片段篩選，一般篩選10-100kb大小的片段進(jìn)行測(cè)序，這就對(duì)我們前期提取的DNA質(zhì)量要求較高。

三代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為復(fù)雜的多倍體基因組組裝帶來(lái)了福音。這種基因組由于倍性多，重復(fù)序列高，而二代測(cè)序局限于產(chǎn)生單倍體間的共有序列，導(dǎo)致此類(lèi)物種的研究停滯不前。而ONT平臺(tái)由于其長(zhǎng)讀長(zhǎng)，跨越完整的重復(fù)區(qū)域，大的結(jié)構(gòu)變異也得到了很好的檢測(cè)。eg. 納米孔測(cè)序技術(shù)可以將T-DNA結(jié)構(gòu)的分辨率提升到36Kb。這就意味著，在這類(lèi)突變體功能基因定位時(shí)，可以直接通過(guò)測(cè)序的方式，找到材料中T-DNA的插入位置及拷貝數(shù)，從而找到功能基因，實(shí)現(xiàn)基因克隆。和傳統(tǒng)的圖位克隆比較，將大大縮短定位周期。傳統(tǒng)的自然突變材料，如果已經(jīng)有定位區(qū)段，應(yīng)用二代檢測(cè)SNP，ONT檢測(cè)SV的方式可以讓我們的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因組組裝方面，以生菜基因組為例，短讀長(zhǎng)的二代測(cè)序組裝出21116個(gè)contig和2.21G的基因組，基于ONT平臺(tái)，則產(chǎn)生了1169個(gè)contig，contig N50為7.3Mb。二代數(shù)據(jù)產(chǎn)生了想較于三代數(shù)據(jù)18倍的contig用于基因組組裝，而三代平臺(tái)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)為高質(zhì)量的基因組組裝提供了便利。在轉(zhuǎn)錄組研究方面，ONT平臺(tái)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)可以為我們帶來(lái)完整的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的序列，且可做定量研究，這將避免二代短片段數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄本組裝上的錯(cuò)誤，更好的應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組研究。

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ONT測(cè)序技術(shù)在多個(gè)方面具有非常強(qiáng)悍的優(yōu)勢(shì)，然而，一份合格的下機(jī)數(shù)據(jù)才是科研成功研究的基礎(chǔ)，為保證得到準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)分析和定量結(jié)果，需要對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控評(píng)估。那么我們今天一起學(xué)習(xí)一下《Summary statistics and QC tutorial》，ONT官方提供的對(duì)測(cè)序raw?data進(jìn)行全面數(shù)據(jù)質(zhì)控的教程。

介紹

此教程適用于指導(dǎo)對(duì)單個(gè)nanopore測(cè)序芯片產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估的主要內(nèi)容如下所示：

1、測(cè)序產(chǎn)出（測(cè)序得到多少reads，多大數(shù)據(jù)量）；

2、測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和長(zhǎng)度分布；

3、如果加入了barcode序列進(jìn)行混樣建庫(kù)，測(cè)序數(shù)據(jù)在不同樣品的分布。

準(zhǔn)備

直接到教程的github頁(yè)面下載或通過(guò)git命令下載：

git clone https://github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc.git QCTutorial

后續(xù)分析會(huì)用到下載目錄QCTutorial下的以下內(nèi)容：

1) Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd：Rmarkdown文件，說(shuō)明文檔和用于執(zhí)行分析。

2) RawData/lambda_sequencing_summary.txt.bz2：示例文件，Guppy對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行堿基識(shí)別生成的相關(guān)信息文件。

3) RawData/lambda_barcoding_summary.txt.bz2：示例文件，用于區(qū)分混樣建庫(kù)時(shí)多樣品的barcode信息。

4) environment.yaml：指定分析所需軟件包及計(jì)算環(huán)境的文本文檔。

5) config.yaml：配置文件，用于指定分析所需的輸入。

2、創(chuàng)建Conda環(huán)境

為了方便執(zhí)行分析所需軟件包及其依賴(lài)的安裝及管理，需要安裝Conda并創(chuàng)建用于此分析的環(huán)境。

1)?Conda安裝（Python3版本的Miniconda）：

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash

2)?創(chuàng)建Conda環(huán)境及環(huán)境激活（第1步中下載的environmen.yaml用于環(huán)境初始化）：

創(chuàng)建環(huán)境：conda env create –name BasicQC –file environment.yaml

激活環(huán)境：source activate BasicQC

分析

進(jìn)行分析之前需先準(zhǔn)備配置文件，通過(guò)修改準(zhǔn)備步驟下載的config.yaml中相應(yīng)的參數(shù)來(lái)完成，需要修改的內(nèi)容主要有：

注：如為單樣品測(cè)序無(wú)barcode信息，則barcodeFile部分為空。

準(zhǔn)備完成后，可以通過(guò)命令行啟動(dòng)分析，命令如下：

R –slave -e ‘rmarkdown::render(“Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd”, “html_document”)’

如果習(xí)慣圖形界面操作，也可以通過(guò)Rstudio載入Rmarkdown文件執(zhí)行分析：

結(jié)果

上述分析完成后會(huì)將分析結(jié)果存放至HTML文件，可用瀏覽器打開(kāi)Nanopore_SumStatQC_Tutorial.html進(jìn)行查看。對(duì)單個(gè)芯片約1M reads分析的部分結(jié)果展示如下（結(jié)果來(lái)自教程，堿基識(shí)別使用Guppy 2.1.3，根據(jù)識(shí)別序列的平均質(zhì)量值將其分為pass和fail兩種，質(zhì)量值閾值默認(rèn)為7）：

1、總結(jié)

展示了數(shù)據(jù)產(chǎn)出的總體情況（如下圖，本分析中堿基識(shí)別共產(chǎn)出991,715條序列，14.6G堿基）。

2、質(zhì)量長(zhǎng)度

此部分展示了對(duì)識(shí)別出的所有序列質(zhì)量和長(zhǎng)度信息的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，包括序列的平均長(zhǎng)度，N50和平均質(zhì)量，序列長(zhǎng)度和質(zhì)量的密度分布等

3、測(cè)序表現(xiàn)

此部分內(nèi)容統(tǒng)計(jì)了隨測(cè)序時(shí)間變化，測(cè)序累計(jì)序列個(gè)數(shù)，堿基個(gè)數(shù)，測(cè)序速度和有效工作納米孔數(shù)等指標(biāo)的變化情況。

4、區(qū)分混樣

在加入barcode序列混樣測(cè)序的情況下，barcode識(shí)別區(qū)分的結(jié)果展示如下，包括barcode識(shí)別效率，區(qū)分的文庫(kù)個(gè)數(shù)及每個(gè)文庫(kù)中序列個(gè)數(shù)占比和長(zhǎng)度信息等。

上面展示了分析結(jié)果的部分內(nèi)容，更多細(xì)節(jié)的內(nèi)容可參考底部的相關(guān)鏈接。

rawdata的質(zhì)控評(píng)估只是整個(gè)信息分析的開(kāi)始，是為了對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)有大致的整體認(rèn)識(shí)，以便更好地指導(dǎo)后續(xù)分析。然而分析的每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生影響，因此每一步的處理都要深思熟慮。

小編寄語(yǔ)

2018年8月牛津納米孔公司與百邁客公司達(dá)成長(zhǎng)期合作，擁有MinION、GridION X5和PromethION三種型號(hào)全套納米孔測(cè)序儀。至今已積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組成功案例先后發(fā)表在《Plant Biotechnol J》、《J Hazard Mater》、《Biotechnol Biofuels》、《Sci Rep》、《Fish & Shellfish Immunology》等國(guó)際知名期刊，已發(fā)表文章研究物種分別有楊樹(shù)、吳松草、風(fēng)箏果、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔紅點(diǎn)鮭和辣椒，覆蓋領(lǐng)域分別為林木、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、水產(chǎn)和作物等。

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參考鏈接:

https@//github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc(@換成:)

https@//community.nanoporetech.com/knowledge/bioinformatics(@換成:)