中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時(shí)間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無(wú)系統(tǒng)的方法預(yù)測(cè)對(duì)IBD療法的反應(yīng)?？寡姿幬锩郎忱?，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時(shí)間的推移，超過(guò)一半的IBD患者對(duì)5-ASA沒(méi)有反應(yīng)或最終失去反應(yīng)。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點(diǎn)

1、來(lái)自IBD患者的多組學(xué)研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項(xiàng)目炎癥性腸病多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對(duì)79名克羅恩?。–D）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進(jìn)行多組學(xué)分析，共鑒定了1036個(gè)宏基因組（MGX）、440個(gè)元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個(gè)非靶向代謝組（MBX），以及283個(gè)MBX-MGX對(duì)和213個(gè)MGX-MTX對(duì)。隨后針對(duì)13名新使用5-ASA的患者來(lái)確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進(jìn)一步評(píng)估微生物、宿主和其他因素對(duì)這些差異顯著的代謝物的相對(duì)貢獻(xiàn)，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預(yù)測(cè)能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過(guò)另一個(gè)獨(dú)立的IBD患者隊(duì)列中鑒定并驗(yàn)證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙?；?-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來(lái)解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過(guò)微生物組進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來(lái)確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對(duì)服用及未服用5-ASA的患者微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個(gè)顯著過(guò)表達(dá)的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個(gè)具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計(jì)算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個(gè)元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個(gè)假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個(gè)之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和?；o酶A N-?；D(zhuǎn)移酶兩組，其中?；o酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來(lái)自擬桿菌門，而硫解酶來(lái)自厚壁菌門。通過(guò)研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和酰基輔酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測(cè)硫解酶和?；o酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來(lái)自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來(lái)自福氏假單胞菌的?；o酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進(jìn)一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)乙?；?-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實(shí)了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測(cè)試了硫解酶對(duì)其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙?；钚裕Y(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；?，這表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個(gè)預(yù)測(cè)的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙酰化為N-乙?；?-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙酰化5-ASA，將FcTHL的乙?；磁潴w晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙?；蚪饷妇w結(jié)構(gòu)上，與來(lái)自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復(fù)合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點(diǎn)是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點(diǎn)，最終揭示了活性位點(diǎn)區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙?；钚缘淖C實(shí)

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)

基于臨床服用5-ASA的個(gè)體差異性，接下來(lái)檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時(shí)間點(diǎn)接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個(gè)參與者的NAT2表型來(lái)解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來(lái)自硫解酶超家族，一種來(lái)自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開(kāi)始使用類固醇的更高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；從未使用過(guò)5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒(méi)有正相關(guān)。隨后使用混合效應(yīng)模型對(duì)參與者進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個(gè)或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

研究總結(jié)

本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個(gè)體通常進(jìn)展為風(fēng)險(xiǎn)更高的免疫抑制治療，而只有在必要時(shí) (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學(xué)機(jī)制可能有助于未來(lái)研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強(qiáng)5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來(lái)加強(qiáng)我們的發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是通過(guò)在IBD患者中的臨床試驗(yàn)還是通過(guò)單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個(gè)性化微生物醫(yī)學(xué)打開(kāi)了一扇概念之窗。